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引子Hello小伙伴们公共好，我是生信技巧树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第八期。第七期咱们使用AddModuleScore_UCell函数计较细胞的增殖和转移评分。本期，咱们将使用monocle2进行拟时序分析。
1.布景先容系列推文前七期，咱们共同学习了单细胞测序的基础分析，从第八期启动，咱们将不断学习拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis），“Copykat”分析及细胞通信等高均分析。
疾病是一个动态变化的过程，在疾病发生发展的过程中，细胞景况随时分不断变化。现存的单细胞测序工夫提供的是某一时刻的“快照”，关联词通过拟时序分析，咱们不错推断出细胞的动态变化过程。
拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）的界说如下：
拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）是一种分析举止，频繁用于参议那些在时分上不连气儿的数据集。它试图通过模拟时分序列的步地来分析数据，即使数据自身并不是按照时分划定收罗的。这种分析举止在多个限制皆有应用，比如在生物信息学中，它不错用于分析基因抒发数据，即使这些数据不是在连气儿的时分点上收罗的。拟时序分析的要害在于构建一个编造的时分轴，然后在这个时分轴上对数据进行排序和分析。这频繁触及到以下几个举止：数据预惩处：清洗数据，确保数据的质地和一致性。特征采取：识别和采取对分析有效的特征或变量。时分轴构建：凭证数据的特点构建一个编造的时分轴，这可能基于生物学过程、实验谋略或其他逻辑。排序：将数据按照编造时分轴进行排序。分析：使用时分序列分析的举止来分析排序后的数据，比如趋势分析、周期性分析等。考据：通过交叉考据或其他举止来考据分析遵守的可靠性。*
单细胞拟时序分析的主要宗旨包括：
细胞发展轨迹推断：通过分析细胞景况的变化，推断细胞是如何从一种景况发展或分化到另一种景况。细胞景况排序：将细胞按照它们在假设的发展轨迹上的位置进行排序，即使这些细胞并非在连气儿的时分点上被不雅测。生物学过程荟萃：识别细胞在特定生物学过程中的动态变化，如细胞分化、发育、疾病发扬等。要害基因和调控汇聚识别：发面前细胞景况转变中起要害作用的基因和调控汇聚。细胞异质性探究：揭示细胞群体里面的异质性，以及不同细胞亚群之间的关联。细胞气运展望：基于刻下的细胞景况和拟时序轨迹，展望细胞可能的异日发展和分化气运。动态生物学过程建模：构建数学模子来模拟细胞景况的动态变化，为生物学假设提供定量描绘。疾病参议和诊疗靶点发现：在疾病参议中，拟时序分析不错匡助荟萃病理景况下细胞的变化，发现潜在的诊疗靶点。发育过程的细胞谱系构建：在发育生物学中，拟时序分析有助于构建细胞谱系树，荟萃细胞的发祥祥和运。实验谋略疏导：通过荟萃细胞景况的变化，不错疏导异日的实验谋略，举例采取哪些细胞景况进行进一步的实验考据。Monocle是面前最常用的拟时序分析算法，其中枢工夫是一种机器学习算法——反向图形镶嵌(Reversed Graph Embedding)进行降维分析。Monocle2使用DDRtree进行降维分析，而Monocle3则使用UMAP降维，可视化细胞转录特征相同性关联，从而描绘细胞景况过渡轨迹。细胞景况过渡轨迹是“根”到“叶”的树状结构，细胞从根到达分支后，会采取一个分支往远方移动，临了到达叶子，每个细胞的psudotime值是它从叶复返根的距离。
monocle的分析经由与seurat雷同，准备输入文献，创建monocle对象cds(new cell data set)，对数据预惩处，筛选特定基因，降维，计较psudotime值，临了可视化。本期使用monocle2进行拟时序分析。
2.数据分析2.1 导入数据撤消系统环境变量，开拓职责目次，加载R包，采取作念拟时序的亚群，读取恶性上皮细胞RDS文献：
rm(list=ls())getwd()setwd('')library(tidyverse)library(tinyarray)library(data.table) library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)library(monocle)sce.all = readRDS('malignant.rds')sce = sce.alltable(sce$celltype)Idents(sce) = sce$celltype要是用我方电脑，细胞量太大，不错每个细胞亚群抽样 ：
allCells=names(Idents(sce))allType = levels(Idents(sce))# choose_Cells = unlist(lapply(allType， function(x){# cgCells = allCells[Idents(sce)== x ]# cg=sample(cgCells，10)# cg# }))# cg_sce = sce[， allCells %in% choose_Cells]cg_sce = scetable(Idents(cg_sce))2.2 数据准备monocle构建CDS需要3个矩阵：
expr.matrixphenodata（pd）featuredata（fd）expr.matrix：
Mono_tj<-cg_sceMono_matrix<-as(as.matrix(GetAssayData(Mono_tj，slot = "counts"))， 'sparseMatrix')
构建featuredata:
一般需要两个col，一个是gene_id，一个是gene_short_name，row对应counts的rownames：
feature_ann<-data.frame(gene_id=rownames(Mono_matrix)，gene_short_name=rownames(Mono_matrix))rownames(feature_ann)<-rownames(Mono_matrix)Mono_fd<-new("AnnotatedDataFrame"， data = feature_ann)构建phenodata：全国最大的成人色情网
Seurat object中的@meta.data一般会存放表型辩论的信息如cluster、sample的开头、group等，是以采取将metadata调度为phenodata：
sample_ann<-Mono_tj@meta.datarownames(sample_ann)<-colnames(Mono_matrix)Mono_pd<-new("AnnotatedDataFrame"， data =sample_ann)2.3 monocle分析经由构建new cell data set：
Mono.cds<-newCellDataSet(Mono_matrix，phenoData =Mono_pd，featureData =Mono_fd，expressionFamily=negbinomial.size())
newCellDataSet函数中，expressionFamily参数用于指定抒发矩阵的数据类型，有几个选项不错采取：疏淡矩阵用negbinomial.size()；FPKM值用tobit()；logFPKM值用gaussianff()。
稽察phenodata、featuredata：
head(pData(Mono.cds))head(fData(Mono.cds))
Mono.cds异常于Seurat V5构建的Seurat对象，随后需要对数据预惩处（猜想圭臬因子、猜想破裂度）：
Mono.cds <- estimateSizeFactors(Mono.cds)Mono.cds <- estimateDispersions(Mono.cds)
筛选基因，这里不错凭证我方的需要筛选特定的基因：
disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)unsup_clustering_genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.1)Mono.cds <- setOrderingFilter(Mono.cds， unsup_clustering_genes$gene_id)
用DDRtree进行降维分析：
Mono.cds <- reduceDimension( Mono.cds， max_components = 2， method = 'DDRTree')
计较psudotime值：
Mono.cds <- orderCells(Mono.cds)head(pData(Mono.cds))
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2.4 monocle可视化展示State轨迹踱步图：
plot_cell_trajectory(Mono.cds，cell_size = 1)
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展示Cluster/Pseudotime轨迹踱步图：
p1 = plot_cell_trajectory(Mono.cds，color_by="celltype"， size=1，show_backbone=TRUE)p2 = plot_cell_trajectory(Mono.cds，color_by="Pseudotime"， size=1，show_backbone=TRUE) p1+p2
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分面知道：
plot_cell_trajectory(Mono.cds， color_by = "celltype") + facet_wrap("~sample"， nrow = 1)图片
树形图：
plot_complex_cell_trajectory(Mono.cds，x=1，y=2，color_by="celltype")+ scale_color_manual(values =mycolors)+ theme(legend.title = element_blank())
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沿时分轴的细胞密度图：
library(ggpubr)df <- pData(Mono.cds)view(df)
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ggplot(df，aes(Pseudotime， colour = celltype， fill=celltype))+ geom_density(bw=0.5，size=1，alpha =0.5)+theme_classic2()
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Monocle基因可视化：
head(unsup_clustering_genes)s.genes <- c("NOC2L"，"PLEKHN1"，"HES4"，"ISG15")p1 <- plot_genes_jitter(Mono.cds[s.genes，]， grouping = "State"， color_by = "State")p2 <- plot_genes_violin(Mono.cds[s.genes，]， grouping = "State"， color_by = "State")p3 <- plot_genes_in_pseudotime(Mono.cds[s.genes，]， color_by = "State")图片
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拟时辩论基因聚类热图：
#高变基因disp.genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)diff_test <- differentialGeneTest(Mono.cds[disp.genes，]， cores = 4， fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test， qval < 1e-50))plot_pseudotime_heatmap(Mono.cds[sig_gene_names，]， num_clusters=4， show_rownames=T， return_heatmap=T)
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2.5 BEAM分析由于细胞基因抒发模式不同，单细胞轨迹中频繁包括分支。通过BEAM(Branched expression analysis modeling)分析，咱们可找到以依赖于分支的步地调控的基因。
disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)disp.genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)mycds_sub <- Mono.cds[disp.genes，]plot_cell_trajectory(mycds_sub， color_by = "State")beam_res <- BEAM(mycds_sub， branch_point = 1， progenitor_method = "duplicate")beam_res <- beam_res[order(beam_res$qval)，]beam_res <- beam_res[，c("gene_short_name"， "pval"， "qval")]mycds_sub_beam <- mycds_sub[row.names(subset(beam_res， qval < 1e-4))，]plot_genes_branched_heatmap(mycds_sub_beam， branch_point = 1， num_clusters = 3， show_rownames = T)图片
结语本期，咱们插足了单细胞高均分析系列，使用monocle2进行了拟时序分析。下一期，凭证课程安排，咱们将暂时回到Bulk转录组，应用TCGA-STAD数据进行生涯分析。干货满满，宽待公共捏续追更，谢谢！
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